細胞轉染在科學研究中扮演著十分重要的角色，但也是最容易被忽略的一環(huán)。轉染效率的高低不僅影響實驗結果，甚至可能導致得到的實驗結果是無效的。在多種類型核酸的細胞轉染實驗中，研究者們常需要進一步優(yōu)化轉染條件以達到最優(yōu)的轉染效率，特別是較難轉染的細胞，而針對特定細胞類型選擇對應專業(yè)化的轉染試劑只是邁向轉染實驗成功的第一步。
成立于1995年的Mirus Bio，專注及深耕核酸遞轉領域多年，從最早具有低毒性的TransIT ? -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產的TransIT-VirusGEN? (產品年鑒請見圖1)。直至文稿發(fā)布時，使用Mirus產品發(fā)表文章已超過1萬篇，并且發(fā)表文章及Mirus數據庫涵蓋了超過1200種細胞類型。
圖1 Mirus產品年鑒
在細胞轉染實驗中，研究者們常常會忽略轉染效率/成功率的評估，那么是否有對應技術或者方法允許實時監(jiān)測DNA/RNA的成功遞送以及細胞內的分布狀態(tài)呢？Mirus Bio Label IT? 核酸標記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個方向。Label IT? 核酸標記試劑盒可對任何類型核酸，進行高效、直接的標記，并且為on-step的實驗操作。基于非酶反應的標記方法，在不損傷核酸完整性、不影響基因表達的前提下，將選擇的標記 (熒光、生物素、地高辛等)以共價的方式連接到核酸上。
Label IT? 試劑盒有多種標簽可供選擇，包括 Cy?3、Cy?5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT? 核酸修飾試劑盒（胺）也可用于基于胺的功能基團進行DNA或RNA修飾。產品特點如下：
- 可用于標記任何DNA或RNA模板——適用于多種應用 (In vitro & in vivo)，如Crispr基因編輯、核酸遞轉、RNA干擾/表達實驗、FISH、Microarray等；
- 一步法標記——簡單、輕松即可完成穩(wěn)定的模版標記反應；
- 可根據實驗需求或應用，調節(jié)標記的密度——以獲得最佳檢測標記 DNA 或RNA 的靈敏度；
- 基于共價化學反應——對核酸殘基的修飾為永久性、無損傷的，是多種科研應用的理想選擇。
- 什么是核酸標記？如何標記核酸？如何檢測？
絕大多數基于分子和生物學的In vitro 及 in vivo研究都依賴于核酸的標記或標簽，理想情況下，此類標記或標簽不會影響核酸功能以及研究結果。因此，也發(fā)展出來多種核酸標記方式，大致可以歸為以下兩類：
-????? 化學標記法：基于結合核酸的反應基團，比如Mirus Label IT? 核酸標記試劑盒屬于此類，并且整個反應過程并不需要酶的參與。
(1)????? 標簽/標記 (綠色區(qū)域)；
(2)????? Linker，與核酸進行靜電相互作用 (黃色區(qū)域)；
(3)????? Label IT? 試劑以共價形式連接到核酸中活性雜原子的烷基化基團(藍色區(qū)域)。
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圖2. Label IT?標記分子示意圖
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-????? 基于酶反應標記法：通過酶促反應，在該反應過程中加入標記修飾的核酸。
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當待研究的核酸加入標記后，可通過以下兩種方式進行檢測：
-????? 直接檢測：這時，標記的核酸中包含了可用于光學、發(fā)光或產生熒光信號的報告分子。
-????? 間接檢測：標記的核酸帶有標簽或標記，該標記需要特異性的結合報告偶聯(lián)分子，如生物素結合帶有熒光標記的鏈霉親和素，地高辛結合帶有熒光標記的特異性抗體等。
?- Label IT? 核酸標記試劑盒——不改變核酸結構功能
基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用，化學轉染也在該研究領域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA)，常作為研究各種類型細胞中蛋白功能核酸類型，通過有效的knockdown從而影響基因表達。那么，加入Label IT?標記的核酸，是否會改變核酸結構，從而影響到后續(xù)實驗結果呢？
評估測試使用Label IT? siRNA Tracker? 試劑盒，將相同siRNA加入不同標記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒有標記siRNA，轉染后，可通過熒光顯微鏡觀察到帶有標記的siRNA?；虮磉_結果顯示，帶有不同標記的siRNA，其目的基因表達水平近似，意味著加入Label IT?標記的核酸，并不影響目的基因表達及功能 (圖3)。
圖3? Label?IT? siRNA Tracker? 試劑盒評估測試
- Label IT? 核酸標記試劑盒——前沿應用舉例
應用一：使用Label IT?技術，富集CRISPR'd細胞
Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過 Label IT? 技術，富集 CRISPR/Cas編輯成功的細胞?；蚪M編輯實驗面臨最大的挑戰(zhàn)之一是如何從未編輯的細胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細胞，特別當未被編輯的細胞相對于成功編輯的細胞，具有生長/增殖優(yōu)勢，使得細胞篩選變得更加困難。
為了高效的區(qū)分經過基因編輯及未編輯的細胞，作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成復合物及轉染細胞前，使用Label IT?對gRNA進行了熒光標記，實驗流程示意圖如下：
研究結果表明，使用Label IT?標記的gRNA 不會影響基因編輯效率，并且可通過熒光分選/富集成功編輯的細胞群。進一步地，研究者們將該 CRISPR 實驗流程應用于針對多種細胞類型的GADD45B基因編輯實驗。根據細胞類型的不同，經過Label IT?標記的細胞亞群中，其成功編輯細胞占比相對于總細胞群體提了15-40%。
發(fā)表文章信息：
標題:?Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者:?Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志:?Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI:?10.1182/bloodadvances.2017015511
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應用二：使用Label IT?技術，聚焦于免疫系統(tǒng)研究
Label IT? 核酸標記技術可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究。傳統(tǒng)的疫苗注射方法是通過 3 厘米以上長度的針頭進行皮下注射，而微針陣列則是由微米級針頭所組成(示意圖如下)，以無痛的方式細微的的穿透皮膚，進入到富含免疫細胞群，可減少患者的不適感。
為了提高疫苗的效力(efficacy)，通常會將免疫刺激分子或 "激動劑(agonists) "與疫苗的靶標或抗原一同加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明，雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為微陣列中的激動劑(agonists)。并且，研究者們認為帶負電荷的核酸激動劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用，幫助了微陣列的組裝。通過使用 Label IT? Cy?3 和 Cy?5 ，分別針對以上兩種核酸類型進行熒光標記，方便用于查看標記核酸在微針上的分布，這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例，將兩種激動劑均一的加入到微陣中，從而使得精確的調整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能。
發(fā)表文章信息：
標題:?Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者:?Camilla Edwards, Robert Oakes?et al.
雜志:?Nanoscale,?Volume 15, Apr 2023.
DOI:?10.1039/D3NR00333G
- Label IT? 核酸標記試劑盒-產品選擇
Label?IT?試劑盒共有以下四種形式可供選擇，以應對研究人員核酸標記實驗的不同應用場景需求：
- Label?IT??Nucleic Acid Labeling Kits
- Label?IT?Tracker? Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
- Label?IT??siRNA Tracker? Intracellular Localization Kits
- Label?IT??Nucleic Acid Modifying Kits
下表總結了不同種類Label?IT?試劑盒區(qū)別：
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Label?IT? Nucleic Acid Labeling |
Label?IT? Tracker? |
Label?IT? siRNA Tracker? |
Label?IT? Nucleic Acid Labeling Modifying |
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應用 |
in vitro?&?in vivo應用的多種類型核酸標記 |
in vitro?&?in vivo質粒追蹤實驗 |
in vitro?&?in vivo siRNA追蹤實驗 |
DNA氨基修飾 |
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試劑盒組分 |
Label IT? Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns |
Label IT? Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer |
Label IT? Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer siRNA Dilution Buffer |
Label IT? Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns |
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Label?IT? : 核酸比例 |
1 μl? : 1 μg |
0.5 μl? : 1 μg |
1 μl? : 1 μg |
0.5 μl? : 1 μg |
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標記密度 |
每20-60 bp 1個標記 |
每60-140 bp 1個標記 |
每15-40 bp 1個標記 |
每20-60 bp 1個標記 |
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標記物類型 |
Cy?3 Cy?5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 MFP488 地高辛 DNP |
Cy?3 Cy?5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 |
Cy?3 Cy?5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 |
氨基 |
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試劑盒規(guī)格 |
25 μl 100 μl |
50 μl |
50 μl |
25 μl 100 μl |
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- Label IT? 核酸標記試劑盒-實驗優(yōu)化之核酸標記密度
理想的密度取決于被標記的核酸類型及下游應用。在需要直接追蹤核酸的實驗中，更適合較高的核酸標記密度；而在想要維持/完整的還原標記核酸的生物學功能的實驗中，則更加適合較低的標記密度。使用 Label IT? 核酸標記技術，可以輕松調整到理想的標記密度。
Label IT? 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標記密度呈線性相關性(圖 4)。例如，按照說明的初次實驗建議，需加入 5 μl Label IT? 試劑標記 5 μg DNA，此時v:w比例為1:1。在保證孵育時間和 DNA 量不變的條件下，如將 Label IT? 試劑的量降低為 2.5 μl 或 增加到10 μl，標記密度將分別降低一半或增加一倍。
實驗Tips：使用過高的 Label IT? 試劑量（超過建議量的 4 倍），可能會導致核酸裂解或引起 Label IT? 熒光基團淬滅。
核酸標記密度與所使用的 Label IT? 試劑量及反應的孵育時間呈正線性相關?？?/span>通過調整反應中 Label IT? 試劑的用量或反應的孵育時間 (孵育溫度仍為37℃)，可輕松靈活的調整到所需要的理想標記密度。
圖4. 核酸標記密度與Label IT?試劑用量和反應孵育時間成正比
實驗Tips：如何計算核酸標記密度，詳細實驗步驟及方法請見“Calculate Nucleic Acid Labeling Density”。
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Mirus Bio公司介紹
Mirus成立于1995年，始終秉承著為基因遞轉提供最佳方法及最高效的工具。憑借超過 25 年轉染領域的深根細作，獲得了多項技術突破，已成為核酸遞送領域的全球領導者和值得信賴的品牌。Mirus科學家團隊不斷突破轉染技術的極限，推出了VirusGEN?轉染試劑與RevIT?增強劑，進一步提升AAV/Lv產量，助力推動生物治療藥物的降本增效，為CGT領域客戶賦能。
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北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)總代理，始終秉承著專業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶提供優(yōu)質的產品與服務，Mirus熱銷轉染產品常備現貨。如果您對上述產品感興趣，歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網站www.squareinfomatics.com了解更多產品信息。
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